一、MLPA 是什么？

MLPA 是一種用于檢測(cè)特定核酸序列拷貝數(shù)變異的高通量、半定量技術(shù)。它可以同時(shí)檢測(cè)多達(dá)50個(gè)不同的靶序列，包括基因缺失、重復(fù)、甲基化狀態(tài)以及點(diǎn)突變。

核心特點(diǎn)：

1. 高通量： 一次反應(yīng)可檢測(cè)40-60個(gè)不同靶位點(diǎn)。

2. 高效經(jīng)濟(jì)： 僅需少量DNA（20-100 ng），就能獲得相當(dāng)于數(shù)十次傳統(tǒng)PCR或qPCR實(shí)驗(yàn)才能得到的信息。

3. 靈敏度高： 可以檢測(cè)出雜合性缺失和單拷貝的變異。

4. 應(yīng)用廣泛： 可用于DNA和RNA分析。

二、 MLPA 技術(shù)原理（分步詳解）

MLPA 技術(shù)的巧妙之處在于將 探針連接 與 PCR 擴(kuò)增相結(jié)合。整個(gè)過程可以分為四個(gè)主要步驟：

第一步：DNA 變性

將樣本DNA（通常是100-200 ng）加熱至98°C，使其雙鏈解鏈為單鏈。

第二步：探針雜交

降溫至60°C左右，使MLPA特異性探針與目標(biāo)DNA序列進(jìn)行雜交。

MLPA探針的結(jié)構(gòu)（最關(guān)鍵的部分）：

每一對(duì)MLPA探針都包括兩個(gè)半探針：

左半探針： 包含一個(gè)通用引物序列和一個(gè)靶標(biāo)特異性序列。

右半探針： 包含另一個(gè)通用引物序列、一個(gè)靶標(biāo)特異性序列和一個(gè)填充序列。

這兩個(gè)半探針的靶標(biāo)特異性序列是相鄰的，只有當(dāng)它們同時(shí)與目標(biāo)DNAwammei互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，才能進(jìn)行下一步。

第三步：連接反應(yīng)

加入 連接酶。只有兩個(gè)半探針都wanquan雜交到靶序列上，它們才會(huì)首尾相連，被連接酶共價(jià)連接成一條完整的核酸鏈。

關(guān)鍵點(diǎn)： 如果靶序列發(fā)生缺失或點(diǎn)突變，導(dǎo)致探針無法wanquan結(jié)合，連接反應(yīng)就不會(huì)發(fā)生。這是MLPA技術(shù)特異性的基礎(chǔ)。

第四步：PCR 擴(kuò)增

使用一對(duì)通用熒光標(biāo)記引物對(duì)所有成功連接的探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

因?yàn)樗刑结樁己邢嗤耐ㄓ靡镄蛄校钥梢杂猛粚?duì)引物擴(kuò)增所有不同的靶標(biāo)。

為什么能定量？

每個(gè)連接成功的探針，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長度是不同的（由右半探針中的“填充序列"長度決定）。

通過毛細(xì)管電泳分離這些不同長度的產(chǎn)物，并通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度來定量。

基本原理： 在一個(gè)樣本中，某個(gè)靶序列的拷貝數(shù)越高，對(duì)應(yīng)的完整探針就越多，PCR擴(kuò)增后該長度片段的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。

三、 MLPA 工作流程概要

樣本DNA制備。

MLPA反應(yīng)： 將DNA與MLPA探針混合物、緩沖液等混合，進(jìn)行過夜雜交和連接反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增： 使用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。

片段分析： 使用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行分析。

數(shù)據(jù)分析： 專用軟件將樣本的信號(hào)峰值與正常對(duì)照樣本進(jìn)行比較，通過計(jì)算比值來判定拷貝數(shù)。

比值 ≈ 1.0： 正常拷貝數(shù)（二倍體）。

比值 ≈ 0.5： 雜合性缺失（單拷貝）。

比值 ≈ 0： 純合性缺失（無拷貝）。

比值 ≈ 1.5： 重復(fù)（三拷貝）。

四、 MLPA 的主要應(yīng)用領(lǐng)域

MLPA技術(shù)因其高效和靈活，被廣泛應(yīng)用于：

1. 遺傳病診斷：

杜氏/貝氏肌營養(yǎng)不良癥： 檢測(cè)DMD基因大片段缺失/重復(fù)。

2. 脊髓性肌weisuo癥： 檢測(cè)SMN1基因外顯子7的純合缺失。

遺傳性腫瘤綜合征： 檢測(cè)BRCA1/2等基因的缺失/重復(fù)。

染色體微缺失/微重復(fù)綜合征： 如22q11.2缺失綜合征（迪喬治綜合征）、威廉姆斯綜合征等。

3. 腫瘤學(xué)：

檢測(cè)癌基因的擴(kuò)增（如HER2在乳腺癌中的擴(kuò)增）。

檢測(cè)抑癌基因的缺失。

4. 表觀遺傳學(xué)分析（MS-MLPA）：

這是一種特殊形式的MLPA，探針設(shè)計(jì)包含了對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。

通過酶切處理，可以區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，從而用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)，如印記基因疾病（Prader-Willi/Angelman綜合征）和腫瘤中的基因啟動(dòng)子甲基化。

5. 基因分型與點(diǎn)突變檢測(cè)：

通過設(shè)計(jì)特殊的探針，可以檢測(cè)已知的單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變。

五、 MLPA 的優(yōu)缺點(diǎn)

總結(jié)來說，MLPA是一種非常精巧、實(shí)用且高效的靶向拷貝數(shù)分析技術(shù)，在臨床分子診斷和研究中扮演著重要的角色。

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